3. 以稀释的sheep anti mouse albumin第一抗体孵育1 hour，PBS洗三次，每次5min

　　4. 以稀释的bovine anti sheep-FITC 的二抗 孵育45min，PBS洗三次，每次5min

　　胎肝细胞即时分泌蛋白也不会影响到结果吧，爬片之前细胞肯定洗过，然后到固定，蛋白不可能在胞外有广泛的分布，如果白蛋白多的到可以分泌出来，也不会在细胞里检测不到。

　　你的一抗可能真的不适合做免疫荧光，不知还有没有别的抗体可以替换。如果你还有的抗白蛋白抗体，除了做免疫荧光，也可以将细胞裂解提蛋白，试着做一下双抗体夹心ELISA，这个方法敏感性不错，也许可以检测到低表达的蛋白。

　　其实免疫荧光对一抗的要求不象western那么高，能作免疫沉淀的一般也能作荧光，可以考虑调整一下一抗浓度试试；

　　1. 这个一抗是做免疫扩散等实验的，ICC等实验试剂说明上没说做过，不过他们说也可以。所以我想在这个实验中， BSA （或胎牛血清）的封闭可能影响到了一抗和抗原的结合，所以造成无荧光的现象？

　　2. DAPI是我顺便看一下它的效果怎么样的。倒没想证明什么！不用DAPI衬染的就是上面那两张，颗粒好像没这么明显呀！

　　1. 你用BSA封闭，部分BSA会结合在细胞上，如果单抗和BSA有交叉的话，同样会结合在BSA上，这样做下来，整个显色必须条件都有了：细胞-BSA-单抗-FITC标记二抗。现在你说没有荧光，那么单抗自然是不和BSA结合的。倒是BSA封闭后会不会影响单抗和细胞抗原的结合，就不好说了，一般情况下，BSA的封闭是不会影响单抗和抗原的特异性结合的（这是个竞争的问题，除非抗原和BSA存在比较特异性结合，才会影响单抗，你觉得BSA会和小鼠胎肝细胞中的白蛋白结合吗？应该不会吧）

　　2. DAPI这个物质我也不太清楚，只是根据它的吸收峰，推测在515nm激发光下不会有太强的荧光，而且不该是绿色的。515nm的激发光好像本身就是绿色的吧？这个问题我也不是很清楚，还是问问高手。希望野原版主看到此帖能再给点意见吧！

　　3. 你不用DAPI衬染的荧光片也会在胞核有颗粒状荧光吗？如果没有，那说明这些颗粒样的荧光应该是DAPI发出，那么对结果也没什么意义，不能证明你的胎肝细胞中有抗原表达呀。

　　1. “用BSA封闭没有荧光结果，至少说明了单抗还是不和BSA交叉反应的，不然会整张片均有非特异性荧光”。为什么是这样的呀，如果单抗不与BSA反应的话，我应该可以拿BSA做封闭剂用的吧？

　　2. 第三张图片应该是细胞核，我在显微镜下面仔细看过，和 DAPI 在420nM的图像完全一样（上传的照片倍数不太一样），如果 DAPI 在515nM 没有荧光的话，那是不是我的荧光结果是非特异性的（不过为什么只在细胞核中出现呢？）

　　qjzhou2000主任不必客气，我只是尽自己所知说说罢了，可能有不对的地方，就迁就一下吧。

　　1. 不一定单克隆抗体的特异性结合程度就好，一般单抗会有一定的使用范围，做免疫印迹很棒的可能偏就不适合做免疫荧光。（说道这里，你可以先试试将细胞中蛋白提出来，做个免疫印迹鉴定一下抗原在胎肝细胞中的表达情况）你用BSA封闭没有荧光结果，至少说明了单抗还是不和BSA交叉反应的，不然会整张片均有非特异性荧光。

　　2. DAPI与DNA结合后吸收峰是358nm而散射峰是461nm，FITC吸收峰约在490nm处，用420nm的滤光片看到的应该是DAPI的蓝色荧光，非特异性的东西比较少，可能背景会是黑色。用515nm的滤光片，可能看到的是FITC的荧光，此时DAPI应该无荧光。

　　3. 另外看到细胞上点状荧光，这里也不好说算不算特异性的荧光，我以前用Triton 处理过的细胞，也是这样，细胞中点点样的荧光，我觉得不太像是特异性的荧光。

　　4. 不知道你封片之前是否将片子晾干了？以前看到帖子说，晾干后不会整个片子都雾蒙蒙的。另外盖玻片是否干净，盖玻片一定要很干净、透明才不会影响结果观察。

　　1. 上次做的时候做过封闭过的（新生牛血清），未加一抗的对照，结果是没有荧光。所以这次就没有做这个，那我下次再做一次。

　　2. 胎肝细胞的白蛋白表达量应该还好，我的一抗是单抗呀！他试剂说明上说是与牛血清白蛋白不交叉反应的，不明白为什么还能用这个全部封闭？

　　1. 很想看看你封闭后的照片。我觉得前两张照片（未封闭）不像是特异性的荧光，感觉就是非特异性着色，你有没有试过不加一抗的对照，我觉得也会是这个效果。

　　2. 个人认为是你的细胞抗原表达量低或抗原性不强，因而无特异性的荧光。再就是你的一抗特异性不强，二抗工作浓度偏高。（不知道为什么你的整张片子均是绿蒙蒙的，以前也是这样吗？）

　　3. DAPI是可以和DNA结合的荧光物质，常用来对胞核进行标记，后面两张用DAPI尘染后的照片，发出的荧光应该是DAPI和细胞核结合的结果，加上使用triton X100打孔，更利于DAPI的结合。

　　从最后两张图片来看，发荧光的是细胞核，我在显微镜下仔细看过，能不能说明在 BSA 封闭的情况下没有特异性荧光出现？（我买的一抗是单克隆抗体）

　　另外，上面两张图片的荧光好像很弱的，是不是因为打孔的缘故？（我在PBS洗三次的时候，只有最后一次用的是加triton的）

　　结果第1、2组均有荧光（不过荧光好像很弱，不知怎么回事？明天贴张图片，大家帮忙看看）；第3组没有荧光发现！

　　我用DAPI复染了一下，在425nm的滤光片下是蓝色，但在515nm下好像是与FITC一样的颜色? 不知大家有没有注意这个问题？

　　我觉得不像是封闭的问题，胎牛血清不可能完全阻断一抗和抗原的特异性结合。应该是抗原或抗体出了问题，例如：抗原没有完全暴露或表达量低，一抗或二抗工作浓度太低，或者是抗体存放时间太长，效价太低。

　　你检测的是小鼠胎肝细胞中的白蛋白，用牛血清白蛋白封闭会不会不太合适，不会有交叉反应吗？（不过从胎牛血清封闭结果看，似乎没有交叉），还是建议你试一下不封闭，免疫荧光封不封闭对结果影响不是很大，若真有非特异性结合，也是比较好辨认的。

　　2. 封闭我们常用的是含1% BSA的0.15% (wt/vol) glycine ，室温30min