肝纤维化是慢性肝病肝实质损伤后过度修复的过程，以细胞外基质（ extracellular matrix ， ECM ）的过度沉积为主要特征，进一步发展为肝硬化甚至肝癌 [1] ，是威胁人类健康的重要公共卫生问题。目前西医尚无针对肝纤维化的特效药物，近年来研究发现中医药可控制甚至逆转肝纤维化 [2] ，值得深入发掘。中医认为，肝纤维化属络病范畴，其病以邪毒瘀血痰浊等为标，正气亏虚为本，正虚络阻是其基本病机，因此治疗应以扶正通络法，其中尤以“扶正”为治疗的关键。在肝纤维化的治疗中，黄芪是益气健脾扶正的常用药物 [3] 。黄芪为豆科植物蒙古黄芪 Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao 或膜荚黄芪 A. membranaceus (Fisch.) Bge. 的干燥根。《中国药典》载其“味甘，微温，归肺、脾经，生黄芪补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓和敛疮生肌的功效，蜜炙黄芪益气补中”。黄芪常用于肝纤维化的治疗，本课题组前期依据首届全国名中医张之文教授的临床经验，由温病专家冯全生教授创芪甲柔肝方，该方以黄芪为君药，临床治疗肝纤维化疗效显著 [4] 。研究发现黄芪抗肝纤维化的作用可能与调节免疫有关 [5] 。

　　清洁级雄性 SD 大鼠 48 只， 6 周龄，体质量（ 190 ± 10 ） g ，购自成都达硕实验动物有限公司，合格证号 SCXK （川） 2015-030 。动物于室温（ 22 ± 2 ）℃、相对湿度 50% 的环境下，适应性喂养 1 周。动物实验经成都中医药大学实验动物伦理审查委员会批准（批准号 2022-32 ）。

　　SD 大鼠适应性喂养 1 周后，随机将其中 10 只大鼠设为空白组，采用 sc 40% 四氯化碳（ carbon tetrachloride ， CCl4 ）花生油联合 10% 乙醇饲喂的方式对剩余的 38 只大鼠构建肝纤维化模型，持续 8 周，分别于第 4 、 6 、 8 周末处死 2 只小鼠进行肝组织苏木素 - 伊红（ HE ）、 Masson 染色以判断造模效果。造模成功后将所有肝纤维化大鼠随机分为模型组（ n ＝ 8 ）、 AS- IV 高剂量组（ 40 mg/kg ， n ＝ 10 ）和 AS-Ⅳ 低剂量组（ 20 mg/kg ， n ＝ 10 ） [15-16] 。 AS-Ⅳ 溶于 0.5% 羧甲基纤维素钠溶液，各给药组 ig 相应药物（ 10 mL/kg ），空白组和模型组 ig 等体积的生理盐水， 1 次 /d ，连续 6 周。

　　治疗 6 周后，所有大鼠禁食禁水 1 d 后取材。大鼠 ip 3% 戊巴比妥钠（ 1.5 mL/kg ）后，心脏采血 7 mL ，分离血清，用于检测肝功能、血清纤维化标志物等指标。取肝脏，称定质量并记录，观察肝脏颜色及质地并拍照，取数块肝组织液氮速冻，用于 Western blotting 、 qRT-PCR 检测；另取一块肝组织置于 4% 多聚甲醛中固定，用于 HE 及 Masson 染色及免疫组化。

　　按照试剂盒说明，用放射性免疫法检测大鼠血清中 PⅢNP 、 PCⅣ 、 HA 和 LN 水平，采用全自动生化仪检测大鼠血清中 ALT 、 AST 活性。

　　2.4.1HE 染色 大鼠肝组织经多聚甲醛固定、乙醇梯度脱水、包埋、切片后，依次用二甲苯 Ⅰ 、二甲苯 Ⅱ 、无水乙醇 Ⅰ 、无水乙醇 Ⅱ 、 95% 乙醇、 90% 乙醇、 80% 乙醇、 70% 乙醇、蒸馏水洗，然后用苏木素染细胞核、伊红染细胞质，再依次用 95% 乙醇 Ⅰ 、 95% 乙醇 Ⅱ 、无水乙醇 Ⅰ 、无水乙醇 Ⅱ 、二甲苯 Ⅰ 、二甲苯 Ⅱ 脱水、封片，于显微镜下观察并拍照。 肝脏炎症分级参照 Scheuer 评分系统。

　　2.4.2Masson 染色 大鼠肝组织经多聚甲醛固定、乙醇梯度脱水、包埋、切片后，依次将切片放入二甲苯 Ⅰ 、二甲苯 Ⅱ 、无水乙醇 Ⅰ 、无水乙醇 Ⅱ 、 75% 乙醇、自来水洗，然后依次用重铬酸钾、铁苏木素、丽春红酸性品红、磷钼酸、苯胺蓝染色，再用 1% 冰醋酸分化，两缸无水乙醇脱水、封片，于显微镜下观察并拍照。 纤维化评分参照 Metavir 评分系统。

　　大鼠肝组织经多聚甲醛中固定、乙醇梯度脱水、包埋、切片后，依次将切片放入二甲苯 Ⅰ 、二甲苯 Ⅱ 、二甲苯 Ⅲ 、无水乙醇 Ⅰ 、无水乙醇 Ⅱ 、 85% 乙醇、 75% 乙醇、蒸馏水洗，置于柠檬酸抗原修复缓冲液（ pH 6.0 ）进行抗原修复。将玻片置于 PBS 中洗涤 3 次，放入 3% 过氧化氢溶液，室温避光孵育 25 min ， PBS 洗涤 3 次。在组化圈内滴加 3% 牛血清白蛋白均匀覆盖组织，室温封闭 30 min 。轻甩掉封闭液，滴加 Collagen Ⅰ 、 α-SMA 一抗（稀释比例为 1 ∶ 400 、 1 ∶ 2000 ）， 4 ℃ 孵育过夜。玻片置于 PBS 中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，稍甩干后在圈内滴加 HRP 标记的山羊抗兔二抗覆盖组织，室温孵育 50 min 。 PBS 中洗涤 3 次。稍甩干后加 DAB 显色液显色，阳性为棕，自来水冲洗切片终止显色。然后以苏木素复染 3 min ，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。将切片依次放入 75% 乙醇、 85% 乙醇、无水乙醇 Ⅰ 、无水乙醇 Ⅱ 、二甲苯 Ⅰ 中脱水透明，稍晾干，中性树胶封片。于显微镜下观察并拍照，应用 Image-pro plus 6.0 软件进行图像分析。

　　按照试剂盒说明书提取各组大鼠肝组织中总 RNA 并合成 cDNA ，进行 qRT-PCR 分析。引物序列见表 1 。

　　采用 SPSS 20.0 软件进行数据的统计分析，对于符合正态分布、具有方差齐性的数据采用单因素方差分析；对于符合正态分布的数据，不具有方差齐性的数据，采用独立样本 T 检验；对于不服从正态分布的数据，则选择非参数检验中 Mann-Whitney U 方法进行检验。

　　如图 1-A 所示，与空白组比较，模型组大鼠血清中 ALT 和 AST 活性均显著升高（ P ＜ 0.01 ）；与模型组比较，各给药组 ALT 和 AST 活性均显著降低（ P ＜ 0.01 ）。血清肝纤维化标志物结果 见图 1-B ，与空白组比较，模型组大鼠血清中 HA 水平显著升高（ P ＜ 0.05 ）；与模型组比较， 40 mg/kg AS-Ⅳ 可显著降低 HA 水平（ P ＜ 0.05 ）， LN 、 PCⅣ 、 PⅢP 在各组间无统计学差异。

　　如图 1-C 所示，模型组肝组织 HE 染色可见大量肝细胞坏死，细胞肿胀，伴有较多淋巴细胞与中性粒细胞浸润（蓝色箭头），多见肝细胞脂肪变性（黑色箭头），汇管区胆管增生； Masson 染色显示组织中汇管区门静脉与中央静脉周围均可见大量胶原纤维增生（红色箭头），并形成大量纤维横隔，可见大量假小叶。 40 mg/kg AS-Ⅳ 组局部见肝细胞脂肪变性（黑色箭头）及淋巴细胞浸润（蓝色箭头）；局部可见胶原纤维增生（红色箭头）及纤维横隔。 20 mg/kg AS-Ⅳ 组 HE 染色多见肝细胞脂肪变性（黑色箭头）、局部肝小叶中与汇管区周围可见肝细胞坏死溶解； Masson 染色显示组织中汇管区门静脉与中央静脉周围可见较多胶原纤维增生（红色箭头），并形成纤维横隔。各组炎症活动度及纤维化程度评分见图 1-D ， Mann-Whitney U 检验显示，与空白组比较，模型组炎症活动度评分、纤维化程度评分均显著升高（ P ＜ 0.01 ）；与模型组比较，各给药组炎症活动度评分均显著降低（ P ＜ 0.01 ）， 40 mg/kg AS-Ⅳ 组纤维化程度评分显著降低（ P ＜ 0.05 ）， 20 mg/kg AS-Ⅳ 组纤维化程度无统计学差异。

　　HSCs活化是肝纤维化进程中的主要驱动力，抑制HSCs活化是抗肝纤维化药物研究的重要靶标[17]。病毒、酒精、寄生虫等多种病因导致急慢性肝损伤，可直接或间接诱导HSCs活化，活化的HSCs向肌成纤维细胞转化，明显高表达α-SMA[18]。α-SMA的表达情况不仅能反映HSCs的活化程度，还能在一定程度上判断病情及预后[19]。此外，活化的HSCs可分泌Collagen Ⅰ，研究发现阻断Collagen I前胶 的输出可促进HSC 的凋亡[20]。本研究发现，经CCl4及乙醇刺激后，模型组大鼠肝组织α-SMA、Collagen I蛋白及mRNA表达水平均显著升高，提示模型组存在活跃的HSCs活化，AS-Ⅳ治疗后显著下调了α-SMA及Collagen I的表达，说明AS-Ⅳ可抑制肝纤维化大鼠HSCs活化，这与既往的研究结果一致[21]。

　　CXCL12 又被称为基质细胞衍生因子-1 ，在肝脏中主要在HSCs 、肝窦内皮细胞等表达，可随着急、慢性的肝损伤而增高[22] 。CXCR4 是CXCL12 的特异性受体，研究发现，CXCL12/CXCR4 轴可通过募集免疫细胞促进肝脏炎症及纤维化[23] ，其高表达会诱导HSCs 活化增殖[24] ，而抑制CXCL12/CXCR4 轴可促进肝纤维化过程中肝血管重塑、抑制HSCs 增殖和迁移[25-26] 。本研究发现AS-Ⅳ 可显著降低肝组织CXCL12 、CXCR4 的mRNA 及蛋白表达，说明AS-Ⅳ 抗肝纤维化、抑制HSCs 活化的作用可能与抑制CXCL12/CXCR4 轴有关。

　　TXNIP 是一种炎症的内源性调节因子，可在危险信号刺激下与NLRP3 形成TXNIP/NLRP3 复合物，激活NLRP3 炎性体[27] 。研究发现敲除小鼠TXNIP 基因，可显著减少NLRP3 炎性体激活[28] 。NLRP3 炎性体是一种由NOD 样受体（NOD-like receptors ，NLRs ）家族构成的多蛋白复合物，NLRP3 通过招募ASC 和pro Caspase-1 完成炎性体的装配，介导Caspase-1 激活，释放IL-1β[29] 。NLRP3 炎性体活化是肝脏疾病过程中的肝细胞损伤、炎症放大的重要原因[30] 。研究发现，HSCs 中NLRP3 炎性体激活，分泌IL-1β 可直接活化HSCs ，并可通过旁分泌的方式促进周围HSCs 活化，从而促进肝纤维化[31] 。而抑制NLRP3 炎性体活化可改善肝纤维化[32] 。本研究发现，40 mg/kg AS-Ⅳ 可显著降低TXNIP 、NLRP3 、ASC 、IL-1β 的表达，提示AS-Ⅳ 可能参与调节TXNIP/NLRP3 炎性体路径。

　　本研究发现 AS-Ⅳ 可显著减轻CCl4 联合乙醇诱导的大鼠肝细胞损伤及纤维化，并能显著抑制HSCs 活化，其机制可能与抑制CXCL12/CXCR4 轴和TXNIP/NLRP3 炎性体路径有关。

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